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重组蛋白纯化策略

来源:admin  浏览量:  发布时间:2017-12-06 15:46:37

重组蛋白纯化基本原则       

     蛋白的分离纯化是生物工程下游阶段一个比较重要的部分,尤其在基因工程重组蛋白的分离纯化中,上游过程的许多因素会直接影响到下游蛋白的分离,充分利用上游对下游的影响,对蛋白的纯化做一个全面的考虑和整体的设计。是否带有亲和标签,His标签,GST标签等,不同的亲和标签选择不同的纯化方案;可能是可溶性表达,可能形成包涵体,可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤,而包涵体易于分离,纯度较高,但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难,需要对聚集的蛋白进行变复性,通常活性蛋白的得率比较低;是否对宿主细胞具有毒性,从而选择抗毒性的表达系统;怎样选择表达系统,是大肠杆菌表达系统,酵母表达系统还是CHO细胞表达系统,不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程,目标蛋白表达的定位(胞内、细胞内膜、周质空间和胞外),蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统;蛋白的化学性质,是否容易被蛋白酶降解,是否会和一些金属离子,化学成分发生反应;蛋白的物理性质,是否对温度敏感等。从蛋白基因的获取,蛋白基因的克隆,蛋白的表达,做好一个整体的规划,将对纯化工作的方便快捷高效带来关键的影响。  基因工程构建的纯化标记有很多,通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸,这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。GST融合载体,蛋白A融合载体,含组氨酸标记(Histidine-tagged)等,不同亲和标签的蛋白有不同的纯化方案。  

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   选择亲和标签时需考虑的因素  亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的,需要综合的考虑,既要考虑到对目标蛋白结构功能的影响,又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响,以及实际的用途。 (1)亲和标签是否会影响到目标蛋白的结构和功能,大多数情况首选短的多肽标签,这是因为短的肽标签对目标蛋白的结构影响最小,而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠,影响蛋白质的生物学功能。 (2)亲和标签对蛋白质稳定性的影响,亲和标签的加入是否会影响到目标蛋白的正确折叠,是促进目标蛋白的可溶性,还是容易形成包涵体,会不会造成氨基酸C和N端破坏,使目的蛋白表达不完全。 (3)亲和标签所融合的位置,亲和标签可以加在N端,可以加在C端,也进行串联。多数情况下蛋白质的N端区域对蛋白质的功能不是太重要,所以在N端进行融合标签的融合常常能保留蛋白质的生物学功能。由于N端DNA序列对蛋白质的转录翻译影响较大,所以标签加在N端对蛋白质的表达水平影响更大,优化标签的mRNA结构可使表达水平提高。可能有些蛋白纯化后需要去除亲和标签C端融合在去除融合标签后在目标蛋白的C端会有几个氨基酸残留,而小心的选择剪切特异性的氨基酸序列就可以在去除N端亲和标签后得到天然的目标蛋白。 (4)亲和洗脱的条件,有些条件比较温和,而有些条件较为剧烈,选择的亲和表达系统应该不使目标蛋白变性。

     样品的预处理 1.诱导方式:诱导方式的选择上,为了得到正确折叠的目的蛋白,表达菌种的生长情况,菌种是否健壮,是否是单克隆菌种,菌体的浓度是否适合诱导,生长状态不好的表达菌,一方面会造成目的蛋白的错误折叠,造成蛋白大小,形态等发生改变,另一方面会因为IPTG的加入,导致菌体的死亡或者降解。 低温度诱导有助于蛋白二硫键的正确折叠,但对于高温表达的蛋白不适合低温状态,温度过高容易导致包涵体的形成。  

      2.诱导剂:基因的诱导表达基于乳糖操纵子调节机制,没有乳糖存在的时候,阻碍物基因产生阻碍蛋白,阻碍蛋白和操纵子结合,抑制基因的表达;当有乳糖存在的时候,B-半乳糖苷酶和乳糖作用产生异半乳糖,异半乳糖和阻碍蛋白结合,解除抑制,激活基因,开始表达蛋白。诱导的浓度的高低对目的蛋白的表达也会有产生影响。BL21(DE3), Rosetta(DE3)等大肠杆菌表达系统这些菌株都敲除了蛋白酶,并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌体,带有噬菌体21抗性区和 lacI基因,lacUV5启动子,以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因,因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态,就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录,在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产,继而质粒上的目的DNA开始转录。 

      3.抽提方式:进行破壁之前应该选择合适的缓冲组分, 合适的pH 要结合酸碱溶液的滴定调节,尽量低的离子强度 ,加入一些稳定成分稳定成分,EDTA螯合重金属离子,Triton X-100,NP40等表面活性剂,保护非极性表面等。 

      4.确定蛋白质样品的形态,浓度 黏度 体积。有时候得到粗蛋白的时候,会观是否符合目的蛋白的一些性质,确保得到是目标蛋白。粗蛋白的形态有没有明显的差异,浓度是否符合纯化的要求,是否有较多的干扰物质,核酸 色素 强结合成分。  

       5.优化表达条件 

   (1)重组蛋白不表达或者表达量低。如果重组蛋白不表达(包含体和可溶蛋白都没有)通过改变诱导剂浓度,诱导温度,时间等都不表达的时候,然后尝试更换菌株、质粒载体。 降低诱导后培养温度。重组蛋白表达得越慢,其折叠效果就越好,大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白,而将培养温度降低至25-30℃就能显著改善蛋白折叠。此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达; 减少诱导剂。诱导剂浓度可以降低至1/10;选用Lac渗透酶缺陷型菌株,如Tuner、Rosetta等,也有很好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相同。重组蛋白在所有细胞中的表达水平相当时,减少诱导剂的效果更好。  

  (2)检查密码子构成,使其适应宿主菌的密码子偏好。稀有密码子,尤其是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子,会降低mRNA稳定性,显著降低翻译速度,引起翻译提前中止、翻译移码和突变。将这些稀有密码子(尤其是N端!)突变为宿主偏好的密码子,能够显著提高表达水平。改善蛋白稳定性。能够引起蛋白降解的因素很多,从蛋白自身性质到宿主性质不一而足,如果重组蛋白在表达时就被降解,表达量和稳定性就会受到很大影响。在大肠杆菌中表达重组蛋白,需要牢记N端法则:当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp时,重组蛋白半衰期只有2分钟,而小侧链的氨基酸残基,如Ala,则可以提高蛋白稳定性。因此在设计载体时,要特别注意第二个密码子,避免上述残基的出现。 处理高毒性蛋白:毒性极高的重组蛋白,其本底表达就会杀死原核宿主,质粒容易丢失,使其在大肠杆菌中很难得到高表达。采用可表达T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂,采用含有T7溶菌酶质粒的宿主,如pLysS,可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底表达量,在受到IPTG诱导时也能较好的表达蛋白。        

   (3)包涵体表达:包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间摸索等,即使包涵体蛋白成功复性,其均一性和活性依然备受质疑。但是包涵体表达也有其优势:能够很轻松的获得超高的表达量,不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解,重组蛋白的毒性被大大抑制,杂蛋白含量低(~10%),容易纯化等。由于这些优点以及蛋白质复性条件的不断发展,表达包涵体蛋白逐渐为人们所接受,成为重组蛋白表达的一个常用方案。与可溶蛋白相反,提高培养温度、延长培养时间、在较高的菌密度下诱导都有利于包涵体的形成;在破菌和变性溶解时加入还原剂能够打开错配的二硫键;在复性液中加入二硫键异构酶、脯氨酸异构酶、分子伴侣和蛋白的辅助因子可以帮助重组蛋白折叠;精氨酸和高分子量PEG能减轻蛋白分子的聚集;尝试多种物理手段,如透析、快速稀释和柱上复性等,有时对复性有奇效。包涵体的表达相对简单,但其复性过程仍是依赖经验的,没有通用的方法可以套用。

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